Estructuras de la región 3’ no codificante del genoma viral que regulan la replicación del virus del dengue

FILOMATORI CV; IGLESIAS NG; VILLORDO SM; GAMARNIK AV

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue (DENV) pertenece a la familia Flaviviridae. Su genoma es una molécula de ARN simple cadena de polaridad positiva de 11 kb. Los extremos 5’ y 3’ no codificantes del genoma (UTRs) contienen dos pares de secuencias complementarias (UAR y CS) capaces de mediar la interacción RNA-RNA de largo alcance, la cual lleva a la circularización del genoma del DENV. La amplificación del ARN viral es catalizada por una ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el genoma viral (NS5). El objetivo de nuestro trabajo es entender el mecanismo por el cual la NS5 inicia la síntesis de ARN. Estudios previos de nuestro laboratorio nos permitieron proponer el primer modelo para explicar la síntesis de ARN de un flavivirus. Según el modelo, la NS5 se une a un elemento promotor (SLA) ubicado en el extremo 5’ del genoma y luego, a través de la interacción RNA-RNA entre los extremos del genoma, es transferida al sitio donde la polimerasa debe comenzar la síntesis del ARN (el 3’ Stem Loop o 3’SL). Con el fin de estudiar los requerimientos generales del extremo 3’ para la actividad polimerasa, generamos moléculas de ARN conteniendo el SLA y diferentes secuencias y/o estructuras en su extremo 3’. Analizamos in vitro su interacción con NS5 mediante ensayos de retraso de la movilidad electroforética y su efectividad como molde para la síntesis de ARN. Estos estudios indicaron que aquellas moléculas de ARN con elementos estructurados en su extremo 3’ fueron incapaces de interaccionar con NS5 y no sirvieron como molde para la síntesis de ARN. Por el contrario, las moléculas de ARN con nucleótidos no involucrados en la formación de estructuras secundarias en el extremo 3’ formaron complejos de alta afinidad con la proteína y fueron activos para la síntesis de ARN. De acuerdo con la predicción de estructura secundaria, cuando las secuencias UAR y CS de los extremos del genoma interaccionan, se inducen cambios conformacionales en el ARN, que incluyen la apertura de la región inferior del 3’SL. Para investigar si este cambio conformacional permite que los nucleótidos terminales del genoma se encuentren accesibles para la polimerasa viral, diseñamos nuevas moléculas de ARN en la cuales, mediante la incorporación de mutaciones puntuales, imitamos las interacciones de largo alcance. Este diseño fue suficiente para permitir una síntesis eficiente de ARN. Estos resultados indicaron la necesidad de la apertura del extremo 3’ del genoma para que NS5 inicie la síntesis de ARN.  Finalmente, debido a que la secuencia 3’UAR se localiza en la base del 3’SL y su interacción con 5’UAR estaría directamente involucrada en la apertura del 3’SL, estudiamos la función de la hibridización 5’-3’ UAR en la utilización del 3’UTR como molde. Este análisis nos permitió concluir que la utilización del 3’UTR del virus del dengue como sitio de iniciación de la síntesis de ARN requiere un cambio en la estructura del 3’SL. En este marco proponemos un modelo en el cual la hibridización 5’-3’ UAR podría posibilitar dicho cambio estructural.