El equilibrio monómero-dímero con interacciones alostéricas en la NS3 helicasa del virus del dengue permiten explicar las isotermas de unión del ARN

LEOPOLDO G. GEBHARD; SERGIO B. KAUFMAN; ANDREA V. GAMARNIK

Ciudad de Buenos Aires

Encuentro; XL Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2011

Sociedad Argentina de Biofísica

La proteína NS3 del virus del dengue presenta una masa molecular de aproximadamente 69 kDa y está constituida por dos superdominios. Uno de ellos (NS3h), entre la posición 171 y el extremo C-terminal (53 kDa), posee actividades helicasa, nucleósido trifosfatasa (NTPasa) y 5'-ARNtrifosfatasa. Se lo clasifica dentro de la superfamilia 2 (SF2) de helicasas y pertenece al grupo DExH. Los estudios cristalográficos revelan que esta helicasa posee tres dominios. Entre los dos primeros se ubica el sitio de unión de nucleótidos y en el surco de la unión del tercer dominio se halla el sitio de unión a ARN. En este trabajo caracterizamos la interacción entre la proteína NS3h y el ARN de cadena simple. Llevamos a cabo titulaciones fluorimétricas en modo reverso entre la proteína y un ARN de 10 bases con fluoresceína en su extremo 5’. Las titulaciones se efectuaron a 30°C en buffer Hepes 25 mM de pH =7.0, KCl 20 mM, MgCl2 2 mM y DTT 2 mM. El análisis de las curvas de titulación reveló que el ARN se une a la NS3h con estequiometría 1:1 con isotermas de unión no hiperbólicas. Un modelo termodinámico de equilibrio monómero-dímero de la NS3h fue capaz de explicar dichas isotermas. El modelo también predice que el ARN induce la formación de dímeros y, si bien los sitios del monómero siguen activos en el dímero, la oligomerización origina interacción alostérica entre ellos. La afinidad intrínseca del primer y segundo sitios del dímero son 15 veces superior y 6 veces menor que la del monómero respectivamente. El valor de la constante de equilibrio para la unión NS3h/ARN en el monómero es K1 = 0.075 nM-1, y la constante de equilibrio de dimerización, K2 = 2.25 nM-1. Estudiamos luego la interacción NS3h/ARN en presencia de detergente. Repetimos las titulaciones NS3h/ARN descriptas arriba pero en presencia de 0.05 % de CHAPS. En estas condiciones experimentales la isoterma de unión es hiperbólica con estequiometría 1:1 NS3h-ARN y una constante de equilibrio de 0.07 nM-1. De modo que la presencia de detergente impidió la formación de dímeros de NS3h observándose que el valor de la constante de equilibrio NS3h-ARN del monómero es prácticamente igual en presencia como en ausencia de detergente