Mapeando la accesibilidad al solvente de la cadena polipeptídica.

GÓMEZ G.E; MUNDO, M.R.; CRAIG P.O; DELFINO J.M

Congreso; XL Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB).; 2011

SAB

La habilidad de las proteínas para plegarse, unirse a ligandos y formar complejos específicos y estables con otras proteínas es fundamental en los procesos biológicos. Conocer las bases moleculares de estos mecanismos requiere entre otras cosas, el análisis de la naturaleza y la extensión del área superficial accesible al solvente (SASA), un parámetro geométrico de importancia central y para el que no existen medidas experimentales directas. Para abordar la estimación experimental del SASA utilizamos el gas fotorreactivo diazirina (DZN) como sonda mimética del agua, debido a la ausencia virtual de especificidad química de la especie reactiva generada (metilén carbeno, :CH2) y al tamaño mínimo de la molécula precursora (DZN). :CH2 se inserta en uniones del tipo X-H, formando enlaces covalentes que dan lugar a productos metilados estables. 3H-DZN fue empleado en el estudio de la estructura y plegamiento de proteínas acuosolubles y en la identificación de la superficie de contacto de un complejo antígeno-anticuerpo. En este contexto, incorporamos la espectrometría de masa (MS) como técnica analítica para obtener una señal alternativa (no radiactiva) que permita cuantificar el grado de modificación (metilación) de la cadena polipeptídica. La transición conformacional nativo-desnaturalizado de a-lactalbúmina bovina fue monitoreada a través de la medida del grado de marcación con DZN, obteniéndose resultados comparables con otras técnicas espectroscópicas clásicas (emisión de fluorescencia y CD). Consecuentemente, nuestro interés se enfocó a la identificación de los sitios marcados a lo largo de la cadena polipeptídica. La fotomarcación con DZN y posterior fragmentación enzimática de la proteína permitió localizar la modificación covalente a lo largo de la secuencia de aminoácidos y construir un mapa de accesibilidad al solvente. Mediante el análisis subsecuente de los péptidos por MS/MS demostramos la factibilidad de la resolución de sitios modificados a nivel de aminoácido individual. En suma, la fotomarcación con DZN acoplada a la detección por MS, resulta útil en el estudio conformacional del estado nativo, así como también de los elusivos estados no-nativos, no abordables fácilmente por otras metodologías. Con subsidios de UBACyT, CONICET y ANPCyT.