Silenciamiento del gen ftsZ mediante tecnología antisentido: implicancias en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas”

DAVIES SALA, C.; SOLER BISTUE, A J C; ZORREGUIETA, A; TOLMASKY, M E

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso Argentino de Microbiología; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

La proteína FtsZ es un análogo bacteriano de la tubulina, altamente conservada en el Dominio Bacteria y cuyo correcto dosaje es clave para la división celular. Una disminución del mismo es suficiente para imposibilitar la supervivencia de la célula. La ARNasa P es capaz de mediar el corte de una molécula de ARN en presencia de un oligorribonucleótido complementario, conocido como External Guide Sequence (EGS). Para que cumpla dicha función, el EGS debe poseer ciertas características que determinan la estructura adecuada cuando interacciona con el ARN blanco. La tecnología EGS se ha empleado con éxito para silenciar diversos genes bacterianos. Recientemente, hemos determinado que oligonucleótidos híbridos que contienen residuos de ADN y ácidos nucleicos cerrados (LNA) son resistentes a nucleasas bacterianas pero de todas maneras son capaces de inducir la actividad de ARNasa P. Estas propiedades les permiten generar el silenciamiento del gen de resistencia a amikacina aac(6’)Ib en células naturalmente permeables cuando son administrados exógenamente. La aplicación de dicha tecnología al silenciamiento de ftsZ podría llevar a la identificación de EGSs con la capacidad de actuar sinérgicamente con antibióticos existentes o, si el efecto es lo suficientemente potente, de constituirse en antimicrobianos de acción independiente. A partir de un modelado in silico (mfold webserver) se diseñaron EGSs complementarios a regiones potencialmente accesibles. Estos EGSs marcados radiactivamente en el extremo 5’ fueron analizados para determinar su capacidad de unión al ARNm ftsZ así como de inducir su degradación. La unión se determinó por ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y la capacidad de inducir degradación se ensayó por incubación del mensajero radiactivamente marcado con las dos subunidades de la ARNasa P (ARN M1 y la proteína C5).  Se diseñaron EGSs complementarios a las dos regiones más extensas predichas como simple cadena. De los dos EGSs diseñados se determinó que sólo el dirigido contra una de dichas regiones (EGS2) fue capaz de unirse al ARN mensajero ftsZ y de inducir el corte en presencia ARNasa P. Dado que pequeñas diferencias en la posición relativa del EGS pueden resultar en grandes diferencias de actividad, se llevó a cabo un estudio de optimización generando EGSs de la misma longitud, pero corridos solapadamente en una, dos o tres bases hacia cada extremo con respecto a la secuencia de EGS2. Se determinó que todos los EGSs fueron capaces de unirse con alta eficiencia y de inducir el corte in vitro del mensajero, uno de ellos con una eficiencia superior al resto.