Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas
INTRANET  I  Registrarse
Usuario
Contraseña
BECAS
ZUBIRÍA María Guillermina
congresos y reuniones científicas
Título:
Caracterización de una preparación de papaína refinada y estabilizada para
Autor/es:
LAURA M. I. LÓPEZ; JULIO R. MERCERAT; MA. GUILLERMINA ZUBIRÍA; ROBERTO BRIONES-MARTÍNEZ
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; Congreso Internacional-Grupo Biotecnología; 2005
Institución organizadora:
Grupo Biotecnología
Resumen:
Introducción Las enzimas que desempeñan el rol central en la degradación de proteínas han sido conocidas tradicionalmente como "proteasas", término equivalente al de "enzimas proteolíticas" y también al más moderno de "péptido-hidrolasas" (Barret, 2001). En términos económicos, las enzimas proteolíticas representan casi las dos terceras partes de las enzimas que se comercializan en el mercado mundial. En un gran número de procesos industriales las endopeptidasas son frecuentemente utilizadas en diferentes etapas de la producción. La mayor parte de estas enzimas provienen de fuentes microbianas, pero varias proteinasas vegetales tales como papaína, bromelina y ficina siguen siendo irreemplazables en un gran número de procesos (Uhlig, 1998). La papaína es la enzima proteolítica de origen vegetal por excelencia; se obtiene a partir del látex de Carica papaya y el crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los últimos años que el mercado mundial se calcula en unos 100 millones de dólares anuales, de los cuales el 70% corresponde a las industrias relacionadas con la alimentación. En esta oportunidad se presenta la caracterización, de acuerdo a los requerimientos internacionales, de una papaína parcialmente purificada (refinada) que se ha obtenido a partir de un desarrollo tecnológico efectuado en el LIPROVE a pedido de una Cooperativa del NOA y que ha sido subsidiado por el FONTAR. crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los últimos años que el mercado mundial se calcula en unos 100 millones de dólares anuales, de los cuales el 70% corresponde a las industrias relacionadas con la alimentación. En esta oportunidad se presenta la caracterización, de acuerdo a los requerimientos internacionales, de una papaína parcialmente purificada (refinada) que se ha obtenido a partir de un desarrollo tecnológico efectuado en el LIPROVE a pedido de una Cooperativa del NOA y que ha sido subsidiado por el FONTAR. crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los últimos años que el mercado mundial se calcula en unos 100 millones de dólares anuales, de los cuales el 70% corresponde a las industrias relacionadas con la alimentación. En esta oportunidad se presenta la caracterización, de acuerdo a los requerimientos internacionales, de una papaína parcialmente purificada (refinada) que se ha obtenido a partir de un desarrollo tecnológico efectuado en el LIPROVE a pedido de una Cooperativa del NOA y que ha sido subsidiado por el FONTAR. Carica papaya y el crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los últimos años que el mercado mundial se calcula en unos 100 millones de dólares anuales, de los cuales el 70% corresponde a las industrias relacionadas con la alimentación. En esta oportunidad se presenta la caracterización, de acuerdo a los requerimientos internacionales, de una papaína parcialmente purificada (refinada) que se ha obtenido a partir de un desarrollo tecnológico efectuado en el LIPROVE a pedido de una Cooperativa del NOA y que ha sido subsidiado por el FONTAR. Metodología El látex proveniente de diferentes variedades cultivadas de Carica papaya fue recolectado en la provincia de Jujuy, Argentina, secado en condiciones controladas de tiempo y temperatura, envasado y enviado al LIPROVE. La determinación de la actividad enzimática se realizó utilizando un sustrato proteico (caseína) bajo normas internacionales (U-USP, AOAC 971.16) y también un sustrato sintético, benzoil-Larginina etilester (BAEE). El proceso de refinado y estabilización está enmarcado en el compromiso de confidencialidad suscripto con la Cooperativa que solicitó el desarrollo. Para cuantificar el contenido de proteínas se utilizó el método de Bradford (1976) que resulta ser muy apropiado para muestras de origen vegetal. En el proceso de liofilización se utilizó un vacío de 50 micrones de Hg y una temperatura primaria de -45°C; el rendimiento de dicho proceso fue determinado sobre la base del contenido final de sólidos totales, proteínas y actividad enzimática. Las proteínas contenidas en las preparaciones de papaína refinada fueron caracterizadas en geles desnaturalizantes con tricina (Shagger & Von Jagow, 1987) y por isoelectroenfoque (IEF) seguido de zimograma (Westergaar et al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. en la provincia de Jujuy, Argentina, secado en condiciones controladas de tiempo y temperatura, envasado y enviado al LIPROVE. La determinación de la actividad enzimática se realizó utilizando un sustrato proteico (caseína) bajo normas internacionales (U-USP, AOAC 971.16) y también un sustrato sintético, benzoil-Larginina etilester (BAEE). El proceso de refinado y estabilización está enmarcado en el compromiso de confidencialidad suscripto con la Cooperativa que solicitó el desarrollo. Para cuantificar el contenido de proteínas se utilizó el método de Bradford (1976) que resulta ser muy apropiado para muestras de origen vegetal. En el proceso de liofilización se utilizó un vacío de 50 micrones de Hg y una temperatura primaria de -45°C; el rendimiento de dicho proceso fue determinado sobre la base del contenido final de sólidos totales, proteínas y actividad enzimática. Las proteínas contenidas en las preparaciones de papaína refinada fueron caracterizadas en geles desnaturalizantes con tricina (Shagger & Von Jagow, 1987) y por isoelectroenfoque (IEF) seguido de zimograma (Westergaar et al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. en la provincia de Jujuy, Argentina, secado en condiciones controladas de tiempo y temperatura, envasado y enviado al LIPROVE. La determinación de la actividad enzimática se realizó utilizando un sustrato proteico (caseína) bajo normas internacionales (U-USP, AOAC 971.16) y también un sustrato sintético, benzoil-Larginina etilester (BAEE). El proceso de refinado y estabilización está enmarcado en el compromiso de confidencialidad suscripto con la Cooperativa que solicitó el desarrollo. Para cuantificar el contenido de proteínas se utilizó el método de Bradford (1976) que resulta ser muy apropiado para muestras de origen vegetal. En el proceso de liofilización se utilizó un vacío de 50 micrones de Hg y una temperatura primaria de -45°C; el rendimiento de dicho proceso fue determinado sobre la base del contenido final de sólidos totales, proteínas y actividad enzimática. Las proteínas contenidas en las preparaciones de papaína refinada fueron caracterizadas en geles desnaturalizantes con tricina (Shagger & Von Jagow, 1987) y por isoelectroenfoque (IEF) seguido de zimograma (Westergaar et al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. Carica papaya fue recolectado en la provincia de Jujuy, Argentina, secado en condiciones controladas de tiempo y temperatura, envasado y enviado al LIPROVE. La determinación de la actividad enzimática se realizó utilizando un sustrato proteico (caseína) bajo normas internacionales (U-USP, AOAC 971.16) y también un sustrato sintético, benzoil-Larginina etilester (BAEE). El proceso de refinado y estabilización está enmarcado en el compromiso de confidencialidad suscripto con la Cooperativa que solicitó el desarrollo. Para cuantificar el contenido de proteínas se utilizó el método de Bradford (1976) que resulta ser muy apropiado para muestras de origen vegetal. En el proceso de liofilización se utilizó un vacío de 50 micrones de Hg y una temperatura primaria de -45°C; el rendimiento de dicho proceso fue determinado sobre la base del contenido final de sólidos totales, proteínas y actividad enzimática. Las proteínas contenidas en las preparaciones de papaína refinada fueron caracterizadas en geles desnaturalizantes con tricina (Shagger & Von Jagow, 1987) y por isoelectroenfoque (IEF) seguido de zimograma (Westergaar et al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. et al., 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. , 1980). Con el fin de evaluar la presencia de clorofilina (absorbancia máxima a 630 nm) se obtuvo el espectro de absorbancia (400-700nm) de la muestra liofilizada y redisuelta en agua. Resultados y Discusión Se determinó la actividad proteolítica del látex seco obtenido a partir de diferentes variedades de Carica papaya cultivadas en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. variedades de Carica papaya cultivadas en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. variedades de Carica papaya cultivadas en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. variedades de Carica papaya cultivadas en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. en la Provincia de Jujuy, Argentina; los datos obtenidos se muestran en la tabla 1. Actividad enzimática, U-USP/mg Muestra 1 56000 ± 700 Muestra 2 57100 ± 500 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 2 57100 ± 500 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 2 57100 ± 500 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 ± 700 Muestra 2 57100 ± 500 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 ± 500 Muestra 3 63100 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000 ± 1000 Muestra 4 65300 ± 1000± 1000 Tabla 1. Actividad proteolítica del látex de variedades cultivadas de C. papaya de variedades cultivadas de C. papaya de variedades cultivadas de C. papaya Actividad proteolítica del látex de variedades cultivadas de C. papayaC. papaya Se seleccionaron los frutos de la muestra 3 porque fueron los mejores productores de látex (ml de látex/g de fruto) con alta actividad proteolítica. El contenido de proteínas del látex seco obtenido a partir de los frutos seleccionados fue de 0,150 mg de proteína/mg y la actividad proteolítica de 63000 U-USP/mg. El producto parcialmente purificado y liofilizado fue obtenido como un polvo seco, de color blanco ligeramente amarillento; los rendimientos en proteínas y actividad enzimática fueron del 90% y los sólidos totales variaron entre 1-3 g%. El análisis del espectro de absorción revela que la preparación no contiene clorofilina (la clorofilina resulta de la hidrólisis alcalina de la clorofila y es un producto soluble en agua que impurifica a la papaína, por lo que se utiliza como un marcador de calidad para el producto). La electroforesis desnaturalizante (Fig. 1) muestra un patrón proteico similar al de la papaína patrón y permite visualizar una banda proteica muy intensa de alrededor de 24 kDa que se corresponde con el peso molecular de las proteasas presentes en el látex de Carica papaya.Carica papaya. El análisis por IEF-zimograma de la muestra liofilizada mostró tres bandas proteicas importantes, todas ellas de pI alcalino y proteolíticamente activas. La utilización de estas técnicas electroforéticas permite una caracterización plena del producto obtenido y deben ser aplicadas como control de calidad para poder detectar la alteración molecular de las enzimas de la papaína que implican un deterioro del producto. 1 2 3 Figura 1. Electroforesis (SDS-tricina- PAGE). Carril 1, muestra de papaína refinada; carril 2, papaína patrón; carril 3, patrones de PM (26, 17, 14 y 6,5 kDa) El producto liofilizado puede ser conservado durante un año a temperatura ambiente (20- 30°C) sin pérdida significativa de actividad enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. PAGE). Carril 1, muestra de papaína refinada; carril 2, papaína patrón; carril 3, patrones de PM (26, 17, 14 y 6,5 kDa) El producto liofilizado puede ser conservado durante un año a temperatura ambiente (20- 30°C) sin pérdida significativa de actividad enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. PAGE). Carril 1, muestra de papaína refinada; carril 2, papaína patrón; carril 3, patrones de PM (26, 17, 14 y 6,5 kDa) El producto liofilizado puede ser conservado durante un año a temperatura ambiente (20- 30°C) sin pérdida significativa de actividad enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. . Electroforesis (SDS-tricina- PAGE). Carril 1, muestra de papaína refinada; carril 2, papaína patrón; carril 3, patrones de PM (26, 17, 14 y 6,5 kDa) El producto liofilizado puede ser conservado durante un año a temperatura ambiente (20- 30°C) sin pérdida significativa de actividad enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. °C) sin pérdida significativa de actividad enzimática (menos de un 5%). La solubilidad es muy buena (25g/100ml). La actividad utilizando BAEE como sustrato dio un resultado promedio de 5 unidades, superando el valor de varias preparaciones comerciales de papaína. Conclusiones Se ha obtenido y caracterizado una preparación de papaína refinada y estabilizada, un producto de alto valor agregado que responde aceptablemente a los requerimientos de empresas nacionales y extranjeras.