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PERSONAL DE APOYO
KEMPFER Ana Catalina
capítulos de libros
Título:
MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Autor/es:
LAURICELLA A.M; KEMPFER AC
Libro:
FUNDAMENTOS PARA EL MANEJO PRACTICO EN EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA
Editorial:
Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis
Referencias:
Lugar: CAPITAL FEDERAL; Año: 2003; p. 82 - 88
Resumen:
MÉTODOS INMUNOLÓGICOS Ana María Lauricella. Ana Catalina Kempfer.   Los métodos inmunológicos utilizan la interacción entre antígeno y anticuerpo con el objeto de identificar y/o cuantificar proteínas plasmáticas y celulares. Se basan en que un anticuerpo reconoce y reacciona específica y sensiblemente con el determinante antigénico que le dio origen, en una reacción primaria rápida, no visualizable.  En ciertas condiciones, los complejos inmunes pueden manifestarse por la aparición de un fenómeno visible (reacción secundaria) como precipitación (cuando el antígeno es soluble), floculación o aglutinación (cuando el antígeno es particulado). A diferencia de las reacciones primarias, las secundarias son más lentas, se aceleran con la temperatura, la agitación y son dependientes de la fuerza iónica del medio. Otros métodos requieren marcación (con enzimas, compuestos fluorescentes o radioisótopos) para identificar y/o cuantificar al antígeno o al anticuerpo, originando métodos más sensibles que los anteriores. En lo referente a proteínas relacionadas al sistema hemostático, los métodos inmunológicos tienen aplicaciones tan diversas como detectar marcadores de activación, identificar inhibidores de la coagulación o cuantificar una proteína (tenga o no actividad biológica) para determinar si su función disminuida puede deberse a la reducción de su síntesis o a la cantidad normal de una molécula alterada. Además, han sido de gran utilidad para esclarecer mecanismos fisiopatológicos. En el mercado existen diferentes equipos comerciales que utilizan variados métodos inmunológicos. La selección de los mismos depende del instrumental disponible. Se aconseja seguir las indicaciones del fabricante en cada caso porque consideran las condiciones empleadas para la estandarización del método e influyen en la exactitud de los resultados.   INMUNOANÁLISIS DE PRECIPITACIÓN Los complejos antígeno-anticuerpo inicialmente formados se agregan en ciertas condiciones, originando micelas insolubles de diferente tamaño. La precipitación en condiciones óptimas ha sido utilizada ampliamente para identificar y cuantificar tanto antígenos como anticuerpos. Los factores que afectan la reacción de precipitación son: las proporciones relativas de los reactantes, las características de los anticuerpos (conocidas como avidez y afinidad), la temperatura, el pH y la concentración iónica del medio. Existe una proporción antígeno-anticuerpo óptima, denominada punto de equivalencia, que produce máxima cantidad de precipitado por la formación de micelas formadas por muchas moléculas de antígenos y anticuerpos. Al aumentar la cantidad de antígeno el precipitado se solubiliza por formarse complejos de menor tamaño, solubles, que no permiten la estructura micelar. Del mismo modo, en exceso de anticuerpo, se forman complejos altamente solubles, con varias moléculas de anticuerpo con una de antígeno. Si bien existen numerosos métodos se describirán los más utilizados.   Inmunodifusión Radial (IDR) Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles de agarosa. La distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con su concentración y en relación inversa con su peso molecular. La IDR es una técnica muy utilizada para cuantificar antígenos, especialmente proteínas presentes en mezclas complejas. Los anticuerpos específicos están disueltos al 1% en una solución de agarosa 1% en solución fisiológica. Sobre portaobjetos, o placas de Petri, limpios y nivelados, se preparan geles de 1,5-2 mm de espesor; se realizan hoyos de 2-3 mm de diámetro; la distancia entre hoyos y al borde del soporte no debe ser inferior a 2 cm. El antígeno colocado en un orificio del gel difunde hasta alcanzar el punto de equivalencia, donde se forma un anillo de precipitación de tamaño proporcional a la cantidad antigénica. La medición del diámetro puede realizarse una vez alcanzado el equilibrio, cuando la precipitación es máxima, o antes del máximo (método tiempo-difusión). En el equilibrio, luego de 48-72 horas de incubación, el tamaño del anillo es independiente del tiempo y velocidad de difusión, aunque es afectado por grandes cambios de temperatura. Existe una relación lineal entre la concentración antigénica y el cuadrado del diámetro del anillo de precipitación o su superficie. Por lo tanto, la concentración de la muestra puede extrapolarse de tablas diámetro-concentración a distintas temperaturas aportadas por los equipos comerciales, o de la curva de calibración realizada en placas armadas en el laboratorio. Antes de alcanzar el tiempo de equivalencia hay una relación directamente proporcional entre el logaritmo de la concentración antigénica y el diámetro del anillo. Este método requiere menor tiempo de incubación (generalmente 24 horas) y diluciones de un estándar en la misma placa (1). Si los anillos de precipitación no se visualizan claramente, pueden teñirse con Azul de Coomassie, previo lavados con solución fisiológica y agua destilada. VENTAJAS: Bajo costo y simplicidad operativa. Límite inferior de sensibilidad= 10-50 mg/mL. DESVENTAJAS: Tiene bajo límite de detección. Requiere períodos de incubación prolongados.   Electroinmunodifusión (Rocket Electroforesis) Es uno de los ensayos inmunológicos más ampliamente usados para cuantificar la concentración de un antígeno proteico. Los antígenos (muestras y curva de referencia) se colocan en puntos alineados cercana y paralelamente al borde catódico del soporte. Cuando se los hace migrar electroforéticamente hacia el ánodo a través de un medio que contiene al anticuerpo policlonal específico, forman líneas de precipitación; el frente precipita y se redisueve sucesivamente en el sentido de la corrida hasta alcanzar su punto de equivalencia, formando picos de precipitación puntiagudos, cuya altura es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra (Figura 1). Luego de numerosos lavados para eliminar el antisuero y tinción (por ejemplo  con Azul de Coomassie), la concentración de la muestra se extrapola de la curva de referencia. Se utilizan soportes con bajo flujo electroendosmótico como agarosa o acetato de celulosa. El pH del sistema se selecciona para que el antígeno migre anódicamente (2). VENTAJAS: Es rápido, económico y preciso. Posee mayor sensibilidad (límite inferior de sensibilidad =1,25-2.5 µg/ml) que IDR. DESVENTAJA: Las concentraciones del antígeno y del antisuero deben ajustarse para que el tamaño de los picos sea adecuado respecto a las dimensiones del soporte. Tiene sensibilidad inferior a los enzimoinmunoensayos.                 ?.........                Figura 1: Rocket Electroforesis. Cuantificación de Factor von Willebrand (VWF).                               1 y 2: muestras problema sin diluir. 3: Pool sin diluir. 4: Pool diluido ½.                                5: Pool diluido ¼. 6: Pool diluido 1/8.         Inmunoelectroforesis Las proteínas de una muestra, separadas electroforéticamente en un gel de agarosa, difunden cuando son enfrentadas con un antisuero específico, formando arcos de precipitación en la zona de equivalencia. Es útil para detectar la unión de la molécula en estudio a otras proteínas, por ejemplo su participación en complejos inmunes.   Inmunoelectroforesis Bidimensional Se realiza una electroforesis de la muestra en la primera dimensión para separar los antígenos según su movilidad y una segunda electroforesis en presencia del anticuerpo en dirección perpendicular a la primera, para acelerar la movilidad antigénica (Figura 2). En el punto de equivalencia se forma una banda de precipitación cuyo perfil dependerá de la cantidad de los componentes de la muestra que reaccionen con el antisuero utilizado. Cuando se utiliza agarosa como soporte, luego de la primera corrida se corta la tira longitudinal del gel que contiene a las proteínas y se la ubica contra otra placa de agarosa a la que se le incorpora el antisuero deseado. Cuando se utilizan placas de acetato de celulosa, la primera corrida se realiza en un extremo de la placa, luego se impregna el soporte con el antisuero (sin que toque los antígenos) y se realiza la segunda corrida en dirección perpendicular a la primera. El control de cada corrida debe colocarse adyacente a la muestra incógnita. Cambios en el perfil de la banda de precipitación indican alteraciones cuali o cuantitativas de la muestra en estudio. Cada proteína de la muestra formará un pico de precipitación, mientras la coexistencia de formas modificadas de una misma proteína provocarán picos envueltos en una banda contínua (Figura 3). El sistema depende de las mismas variables que el método de electroinmunodifusión en una dimensión (3). Deben ajustarse las concentraciones del anticuerpo y la cantidad de antígeno utilizadas para conseguir perfiles adecuados al tamaño de la placa. VENTAJAS: Bajo costo. Da información cuali-cuantitativa. DESVENTAJAS: Es un método laborioso que insume varias horas.                                                                                            Figura 2: Inmunoelectroforesis Bidimensional para Factor von Willebrand (VWF).                               1 y 4 pool normal, 2 paciente con ausencia de multímeros grandes del VWF,                               3 paciente con disminución o ausencia de toda la población  multimérica del VWF.                                                                            Figura 3: Inmunoelectroforesis Bidimensional. Diferenciación de Protrombina monocarbocilada                                      (PIVKAS) y dicarboxilada (FII) en individuos con anticoagulación oral.     Nefelometría La formación de complejos antígeno-anticuerpo en soluciones diluidas produce turbidez al inicio de la precipitación. Las partículas en suspensión difractan la luz a una longitud de onda apropiada. La intensidad de luz dispersada en un ángulo determinado depende de la longitud de onda de la luz incidente, del tamaño y forma de las partículas y de las diferencias entre los índices de refracción de las partículas y del medio. Si el anticuerpo está en exceso, la cantidad de complejo inmune, y por lo tanto la dispersión luminosa serán directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. La concentración antigénica puede calcularse por análisis de punto final a partir de una curva de calibración, registrando la lectura óptica en el equilibrio, a un tiempo prefijado, o por métodos cinéticos, midiendo la absorbancia durante los primeros minutos de la reacción. El agregado de polietilenglicol a la mezcla reactiva aumenta la velocidad de formación de los complejos inmunes en soluciones diluidas, de modo que permite obtener rápidamente resultados exactos con mayor sensibilidad (4). VENTAJAS: Es muy sensible (límite inferior de sensibilidad=0,1 a 1 mg/mL), rápido y reproducible. DESVENTAJAS: Es un método costoso porque, además del nefelómetro, requiere anticuerpos monoespecíficos de alta afinidad. Los resultados son afectados por la presencia de lípidos. Pueden obtenerse valores por exceso cuando los anticuerpos no distinguen entre el antígeno y sus formas degradadas.   MÉTODOS POR AGLUTINACIÓN DE PARTÍCULAS La aglutinación comprende la aglomeración de partículas por reacciones inmunológicas. Las partículas pueden ser bacterias o glóbulos rojos que poseen elevado número de determinantes antigénicos por partícula. Ante la presencia de anticuerpos en la muestra a determinar, las partículas se aglutinan mediante uniones encadenadas entre antígenos y anticuerpos, observándose como grumos separados en la suspensión o formando una malla. En concentraciones próximas al punto de equivalencia, la malla ocupa todo el pocillo (reacción positiva) mientras las partículas libres sedimentan formando un botón en el fondo del tubo o pocillo (reacción negativa). Un exceso de antígeno puede disociar los complejos inmunes formados, produciendo la desaparición del aglutinado. Se puede utilizar como método semicuantitativo comparando diluciones seriadas de la muestra con un estándar (5). La aglutinación puede establecerse visualmente o con la ayuda de un microscopio. Es una técnica más sensible que la precipitación, debido a que la cantidad de epitopes sobre la partícula permite visualizar la reacción en presencia de menores cantidades de reactivos. En la aglutinación pasiva las partículas son soportes inertes, como látex, bentonita, eritrocitos tanados, etc, sobre los cuales se fijan antígenos o anticuerpos específicos por uniones no covalentes, aumentando aún más la sensibilidad del método. Los anticuerpos bivalentes pueden desdoblarse por degradación enzimática o química, transformándose en univalentes o incompletos, que no producen aglutinación. Estos complejos solubles pueden ponerse de manifiesto utilizando el suero de Coombs (anti inmunoglobulina humana), capaz de reconocer los determinantes antigénicos del anticuerpo univalente sobre la partícula, produciendo aglutinación. Es necesario realizar lavados antes de agregar el suero de Coombs para eliminar todos los anticuerpos no unidos a la partícula. VENTAJAS: Es una técnica sensible ((límite inferior de sensibilidad=1 µg/ml), muy rápida y económica. DESVENTAJAS: Requiere controles estrictos, reactivos bien caracterizados y conocer las causas de falsos positivos y negativos. Tiene poca exactitud cuantitativa. Se han desarrollado métodos automatizados de gran sensibilidad (PACIA: particle counting immunoassay) que cuantifican la aglutinación determinando el número de partículas no aglutinadas en un instrumento para recuento celular.   Inmunoturbidimetría Es una técnica útil para determinar la concentración tanto de antígenos como de anticuerpos. En hemostasia generalmente se emplean para cuantificar antígenos. El analito aglutina partículas de látex recubiertas con el anticuerpo específico, generando turbidez. Esto provoca el descenso de la absorbancia, cuya medición  espectrofotométrica es proporcional a la concentración del antígeno en la muestra. Pueden utilizarse métodos cinéticos y de punto final. Se han automatizado métodos inmunoturbidimétricos para cuantificar proteínas de difícil determinación por métodos funcionales. En muchos casos los métodos automatizados reemplazan a la IDR. VENTAJAS: Es una técnica muy sensible ((límite inferior de sensibilidad=0,1-1 mg/mL) rápida y fácil de automatizar. DESVENTAJAS: Es más costosa que IDR.   Inhibición de la hemaglutinación Se agregan cantidades fijas de un anticuerpos a diluciones seriadas de un antígeno de concentración conocida y de la muestra a estudiar. Luego de un período de incubación se agrega una suspensión de eritrocitos con el antígeno adherido a su membrana. Se producirá hemaglutinación sólo en las soluciones que tengan exceso de anticuerpo. La concentración antigénica de la muestra se obtiene por comparación con la curva estándar. VENTAJAS: Aumenta la sensibilidad de la aglutinación (límite inferior de sensibilidad=5-10 mg/mL). DESVENTAJA: No es un método rápido.   INMUNOANÁLISIS CON MARCACIÓN Para evidenciar las reacciones primarias antígeno-anticuerpo, no visualizables por sí mismas, se requiere: ·            Un antígeno purificado y/o preparación del anticuerpo específico para emplear como reactivo. ·            Una técnica de marcación mediante el uso de enzimas, compuestos fluorescentes o radioisótopos, con fines de detección. ·            Un método que permita cuantificar al analito. Los diferentes métodos resultan de la combinación de las siguientes posibilidades: ·            La marcación del antígeno o del anticuerpo. ·            Ser sistemas heterogéneos (fase sólida o no) u homogéneos. Los primeros requieren separar el complejo antígeno-anticuerpo de los componentes libres en solución. ·            Ser competitivos o no competitivos.   Enzimoinmunoensayo (EIA) Es un método sensible para cuantificar tanto anfígenos como anticuerpos. Utiliza una enzima como marcador de la interacción anfígeno-anticuerpo. Esta enzima (generalmente peroxidasa o fosfatasa alcalina) cataliza una reacción química sobre un sustrato, generando un producto coloreado que se determina espectrofotométricamente. Existen muchos sistemas diferentes.   EIA HETEROGENEOS DE FASE SÓLIDA (ELISA) 1.       Método competitivo Generalmente cuantifica la concentración de un antígeno y utiliza como reactivo el antígeno purificado acoplado químicamente a la enzima. Se fija el anticuerpo a la fase sólida (superficie de poliestireno tratado) y se bloquea la zona libre del soporte con una proteína irrelevante como albúmina o leche descremada; se agregan simultáneamente el antígeno marcado con la enzima y la muestra a evaluar. Ambos antígenos (el de la muestra y el marcado) compiten por unirse al anticuerpo pegado al soporte. Su unión será proporcional a la concentración de cada uno de ellos. Los antígenos no unidos a la placa deben ser cuidadosamente eliminados por lavados. Se revela la cantidad de enzima unida mediante la reacción con el sustrato correspondiente. Cuanto mayor sea la concentración del antígeno en la muestra menor será la cantidad de antígeno-enzima unida al soporte y por lo tanto menor el color desarrollado con el sustrato (6). 2.       Método no-competitivo Es el más usado para determinaciones clínicas. Se utilizan micro-placas cuyo interior esta recubierto de antígeno (puede ser de anticuerpo) y bloqueado. Luego de incubar estándares de concentraciones conocidas y la muestra a dosar, se lavan las proteínas no unidas a la placa. Los complejos se detectan con una anti-inmunoglobulina isotipo específica, unida a la enzima (segundo anticuerpo). Cuando se fija un anticuerpo a la fase sólida (primer anticuerpo), el segundo anticuerpo estará dirigido hacia un epitope antigénico diferente de la especificidad del primero, marcado con la enzima. Puede aumentarse la sensibilidad agregando sistemas como avidina-biotina-peroxidasa, peroxidasa-antiperoxidasa, lectinas y moléculas puente. La especificidad puede aumentarse utilizando anticuerpos monoclonales (7) VENTAJAS: Ambos métodos son muy sensibles (límite inferior de sensibilidad=0,5 µg/ml), específicos, simples y reproducibles. El método competitivo ofrece mayor especificidad. Es ideal para medir moléculas pequeñas que pueden ser aisladas, purificadas y marcadas con una enzima o cuando se dispone de pequeñas cantidades de anticuerpo. En el mercado hay equipos para determinaciones automatizadas. DESVENTAJAS: Los equipos comerciales son costosos. El desarrollo en el laboratorio requiere numerosos ajustes y controles muy precisos.   EIA HOMOGÉNEOS En estos sistemas no es necesario separar los componentes libres de los complejos marcados. Se basan en que la interacción antígeno-anticuerpo modula la actividad enzimática. La sustancia a dosar se une covalentemente a la enzima, sustrato, cofactor enzimática o grupo prostético. Esta unión modifica su actividad biológica modificando, finalmente, la actividad enzimática. En algunos métodos se han empleado liposomas: el anfígeno se incorpora en la capa bilipídica de la membrana del liposoma que contiene una enzima determinada. Un anticuerpo especifico y el complemento induce la lisis de los liposomas con la consiguiente liberación enzimática (8). VENTAJAS: Son rápidos, sencillos y adaptables a la automatización. DESVENTAJAS: Generalmente son menos sensibles que los EIA heterogéneos. Requieren reactivos enzimáticas complejos.   ENSAYO DE FLUORESCENCIA LIGADO A ENZIMA (ELFA) Es una variación de los EIA colorimétricos; utiliza un sustrato cuyo producto de la reacción enzimática es fluorescente. VENTAJAS: Son rápidos, adaptables a la automatización, ligeramente más sensibles y de mayor rango de medición que los ensayos  colorimétricos. DESVENTAJAS: Variaciones en el pH, temperatura, concentración iónica, secado, y algunos materiales de las placas, modifican la señal fluorescente inespecíficamente y pueden conducir a diferentes alteraciones: La fluorescencia aumenta cuando disminuye la temperatura, por lo que es importante mantenerla constante en cada ensayo y entre diferentes ensayos. Cuando la luz emitida entra en contacto con moléculas, partículas en suspensión (polvo, impureza, burbujas) o la misma superficie de la microplaca, se produce dispersión de luz. El oxígeno disuelto reduce la señal fluorescente (fenómeno de ?apagamiento? o quenching). Componentes de la muestra, como hemoglobina, bilirrubina o ciertas drogas, por ser autofluorescentes provocan fluorescencia de fondo. Por lo tanto es importante mantener una estricta limpieza, utilizar reactivos químicos de elevado grado de pureza o filtrarlos a través de membranas de 0,45 mm y degaserlos para eliminar las burbujas y el oxígeno disuelto. Además, es conveniente utilizar placas para fluorescencia (generalmente son negras) ya que no autofluorescen, absorben la luz dispersada y reducen significativamente la fluorescencia de fondo.   Inmunoanálisis por fluorescencia (FIA) Estos métodos utilizan compuestos fluorescentes para la marcación. Las mediciones se realizan en un fluorómetro. Los sistemas heterogéneos son semejantes a los ELISA y tienen la ventaja de que eliminan las sustancias de la muestra que producen fluorescencia de fondo. Estos sistemas son rápidos pero tienen sensibilidad limitada. 1. INMUNOANÁLISIS DE FLUORESCENCIA POLARIZADA. La observación de una solución fluorescente en dirección perpendicular a la luz incidente emite fluorescencia parcialmente polarizada- La fluorescencia polarizada de una molécula pequeña es muy escasa, en cambio si forma un complejo se mueve más lentamente y aumenta la polarización fluorescente. Estos cambios permiten distinguir y medir las sustancias fluorescentes libres de las conjugadas (10). VENTAJAS: alta sensibilidad (límite inferior de sensibilidad = 1 ng/mL). Útil para análisis de moléculas pequeñas. Rapidez de medición. Puede automatizarse. DESVENTAJAS: Requiere instrumentos y reactivos especiales muy costosos. No es útil para moléculas grandes como anticuerpos. 2. INMUNOANÁLISIS DE LA PROTECCIÓN DE LA FLUORESCENCIA El antígeno proteico se marca con fluoresceína. El anticuerpo específico para el antígeno (1° anticuerpo) inhibe estéricamente la reacción de un 2° anticuerpo anti-fluoresceína, que a su vez extingue la fluorescencia cuando se une al fluoróforo. O sea que el 1° anticuerpo protege a la fluoresceína de perder su fluorescencia.   Radioinmunoanálisis (RIA) El marcador del antígeno es un isótopo radiactivo. A una mezcla de anticuerpo y una cantidad de antígeno radiactivo suficiente para saturar el 70% de los sitios de unión, se añaden cantidades crecientes de antígeno sin marca, provocando competición por la ocupación de esos sitios y la caída secuencial de la marca radioactiva. Los resultados pueden calcularse del gráfico en escala logarítmica antígeno sin marca añadido vs antígeno marcado combinado. Son métodos muy utilizados para determinaciones hormonales y en laboratorios de investigación. VANTAJAS: útil para determinar bajas concentraciones de antígenos. Muy alta sensibilidad (0,5-5 ng/mL). Facilidad de creación y costo relativamente bajo. DESVENTAJA: requiere equipos y reactivos especiales, con tiempo de vencimiento corto (vida media del iodo radiactivo: 60 días) y licencia para manejo de radioisótopos.   Ensayos inmunorradiométricos (IRMA). Cuando el reactivo marcado isotópicamente es el anticuerpo.   Bibliografia 1.       MANCINI G, NASH DR, HEREMANS JF. Further studies on single radial immunodiffusion III: Qualitative analysis of related and unrelated antigens. Immunochemistry 1970; 7: 261-4. 2.       LAURELL CB. Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarosa gel containing antibodies. Ann Biochem 1966; 15: 45-52. 3.       LAURELL CB. Antigen-antibody crossed immunoelectrophoresis. Anal Biochem 1965; 10, 358-361. 4.       PIZZOLATO MA. Two dimensional electrophoresis on cellulose acetate gel: Improved method for routine protein estimation. Clin Chim Acta 1973; 45, 207-214. 5.       FINLEY PR. Nephepometry: Principal and clinical laboratory applications. Lab. Management 1982; 20: 34. 6.       CASTAMAN G, TOSETTO A, CAPPELLETTI A, et al. Validation of a rapid test (VWF-LIA) for the quantitative determination of von Willebrand factor antigen in type 1 von Willebrand disease diagnosis within the European multicenter study MCMDM-1VWD. Thromb Res 2010 ;126: 227-31. 7.       NILSSON B. Enzime-linked immunosorbent assays. 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